组织培养污染产生的原因及防治措施(黄化&褐化)

  组织培养过程中污染的来源

  外植体自身带菌

  许多植物都是栽培在室外，而空气环境中有大量微生物存在，这些微生物可通过植物自然的孔口或伤口进入植物内部，也有一些兼性腐生菌，可由外植体或通过相应的侵入机制侵入植株内部，如果在接种操作前对这些认识不足，对外植体消毒不严，就很容易发生污染现象。

  培养基或接种工具灭菌不彻底

  在对培养基灭菌过程中，如果灭菌时间过短、灭菌时温度达不到要求、灭菌锅压力记数不准等因素都有可能导致培养基灭菌不彻底，使一些病原微生物残留在培养基中，一旦接种后就会造成污染。使用灭菌不彻底的接种工具，灭过菌的接种工具存放时间过长，都会导致在生产中造成污染，所以生产中要做好培养基和接种工具的灭菌和消毒工作。

  接种室消毒不严

  在组培生产过程中，除了植物本身外，大部分污染来源便是来自接种操作室。因为在接种操作室中，未过滤的空气中含有大量的微生物，这些微生物可随着操作人员或植株接触时而发生污染，所以接种室消毒不严，也易引发污染发生。

  人员因素

  在整个操作室内，人员是最大的带菌者，其不管在毛发或是衣服等，都隐藏着数不清的微生物。这些微生物的存在都可能造成一定的危害。为此在进入操作室前，接种人员的工作服、鞋帽都必须进行消毒处理，进入接种室必须换上消毒过的鞋帽;接种前，接种人员必须认真洗手，还要用70%的乙醇棉球擦拭双手，这样在一定程度上可减轻污染的危害。

  超净工作台上的滤网过滤不彻底

  超净工作台使用过久，或保养不当，而造成滤网坏掉或灰尘过多，导致在接种操作时对空气过滤不彻底，也易产生污染。

  栽培过程污染

  在栽培室，组培瓶外和外界气体交换时，亦会有一些微生物进入。污染几率取决于空气中带菌密度与组培瓶空气交换率。

  防止污染的方法

  认真做好外植体的选择和消毒工作，防止外植体带菌

  对外植体的选择要考虑选择的时间和部位，尽量选取带菌少的材料，在时间上一般在植株的生长旺盛季节，如春季和秋季病原微生物数量相对要少些，对于外植体的部位一般以幼嫩的部位较好。

  另外要做好外植体的消毒工作，目前外植体消毒常用药剂有：70%～75%的乙醇溶液，0.3%～0.6%的次氯酸钠溶液和0.1%的升gong溶液。选用何种消毒剂和消毒时间要根据外植体的幼嫩程度和部位确定，一般要求既将外植体表面的微生物杀死，又要求尽可能少伤害外植体组织和表层细胞。在生产实践中防止外植体污染，也可实行多次灭菌和交替灭菌相结合的办法，最终达到消灭杂菌的目的。

  改善接种室和培养室的环境条件，保证接种与培养环境清洁无菌

  与外植体自身带菌所产生的污染相比,操作污染和环境污染是可以克服的。在组培生产中，真菌的污染一般与环境有关，细菌污染与接种材料及工具有关。生产中要通过定期做好对接种室与培养室消毒工作，减少环境中的微生物数量，减轻对污染的危害。为此，在接种前接种室要认真做好消毒工作，且超净工作台在接种前，认真擦洗，紫外灯要开20～30min左右。培养室的相对湿度应控制在70%左右，对每件物品放到超净工作台上，都要用75%酒精认真擦洗一遍，方可放到台面上，只有这样在一定程度上可控制污染程度。

  操作人员严格遵守无菌操作规程

  接种人员在接种操作中，应严格遵守无菌操作规范要求。接种人员的工作服、口罩、帽子等布质品要定期进行湿热灭菌，在超净工作台的操作区内，不要放入过多的待用物品，避免气流被挡住产生污染。定期清洗或更换超净工作台过滤器，接种前15～20min打开风机，风速调整到20～30m/min，并对台面用75%酒精喷雾消毒，工作人员进入操作室前必须对工作服、鞋帽进行消毒处理，进入接种室必须换上消毒过的鞋帽，接种前，接种人员必须认真洗手，还要用70%的乙醇棉球擦拭双手，只有接种过程中严格遵守操作要规范，才可避免因人为因素造成污染。

  培养基及接种工器具要严格灭菌，确保灭菌质量

  在对培养基和接种工具灭菌时，要先检查灭菌锅的使用情况，发现问题要立即检修。在灭菌过程中要绝对保证灭菌应达到的压力、时间，确保灭菌质量。一般要求压力应达到0.1个大气压，时间维持在15～20分钟，并且压力表降到零后不能马上出锅，防止外界环境的冷空气倒吸入已灭菌的培养瓶内引起真菌污染，应待锅内稍冷却后再出锅。对组培生产过程中培养容器封口采用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等材料，在使用前要认真做好清冼和消毒工作，不符合要求坚决不用。在分装培养基时，勿触瓶口，防止培养基粘在瓶口上，引起污染，瓶口封好后要检查封口是否破损，扎瓶口位置适当，松紧适宜。对已污染组培瓶要经高压灭菌后再清洗。

  在培养基中加入适量的抗生素

  这是目前较常用的方法，抗生素可以直接加入到培养基中，也可以用抗生素喷洒或浸泡外植体。但植物种类不同，所用抗生素的种类、浓度和处理时间也不同，因此必须对不同植物采用不同的抗生素的种类、浓度和处理时间进行实验探讨。

  一般情况下，为消除革蓝氏阳性菌对有些木本植物污染茎段组培苗，可在培养基中加入四环素、头孢等混合物，可使细菌完全被消除。另外用头孢菌素Ⅱ消除某些观赏植物外植体中的内生菌也有非常明显的效果。

  利用病毒在植株体内分布不均匀的原理，生产脱毒苗

  因为病毒在生长点区域几乎不存在，且病毒也难以长到顶芽的分生组织，所以切取顶芽的分生组织进行组织培养，通过组织培养技术就可培养成无病毒植株，而且脱毒效果好，后代遗传性稳定，所以是目前生产无病毒苗最安全、最重要的一条途径。

  利用培养基中高盐或高糖的浓度，抑制微生物的生长

  在培养基中有一些高盐或高糖的浓度可抑制微生物生长，或单宁酸存在时也可以达到抑制微生物生长的效果。

  减少培养基中的某些有机成分，可抑制微生物的生长繁殖

  培养基中有机物如VB1、VB6、烟酸等有机成分，是某些细菌生长的必需物质，除去这些有机物后，细菌无法生长发育，逐渐死亡减少。这样也可在一定程度上减轻污染所带来的危害。

  组培生产中污染的发生是不可忽视的环节，在生产过程中思想上要高度重视，行动上要有严格遵守操作规范，才能在一定程度上减轻污染所带来的危害。

  组培苗的黄化及防治

  组培苗的黄化

  黄化是指在组培过程中由于培养基成分、环境、激素、碳水化合物等各种因素引起的幼苗整株失绿，全部或部分叶片黄化、斑驳。这一现象在植物组织培养中比较常见，特别在部分木本植物、花卉中较为常见。

  影响组培苗黄化的因素

  1、培养基中Fe的含量不足, 各矿质营养不均衡;

  2、培养环境通气不良，瓶内乙烯含量升高;

  3、激素配比不当;

  4、PH值变化过大;

  5、糖用量不足或长时间不转移糖已耗尽;

  6、培养温度不适;光照不足等。

  防治组培苗黄化的方法

  1、首先在配制母液和培养基的制作过程中，要检查仪器设备是否准确，还要认真细致地核对每项称量的每一个环节;

  2、使用透气的封口膜以改善瓶内通气状况;

  3、适当调节pH值、激素配比和无机盐浓度;

  4、配制培养基时切记不要忘记加糖,及时转接培养物;

  5、控制培养室内的温度,适当增加光照;

  6、在培养基中添加抗生素类物质如青霉素、链霉素、头孢霉素等，有时也会出现幼苗黄化现象，应适当减少用量或停止使用。

  组培苗的褐变及防治

  组培苗的褐变

  很多种类的植物体中含有大量多酚类化合物，切取芽时的创伤会激活组织中的多酚氧化酶，将多酚类物质氧化为棕褐色的醌类物质，使外植体的切口处发生褐变，产生可见的茶色、褐色或黑色，此即谓“酚污染”。醌类物质会渗透到培养基中，使培养基褐化，其结果是严重影响培养物的生长和分化，甚至造成培养物死亡。在木本植物，尤其是热带木本植物及少量草本植物中，此现象较为严重。

  影响褐变的因素

  植物的种类褐基因型、外植体的来源和生理状况以及培养基的成分都会不同程度的影响褐变的程度。一般木本植物的外植体比较容易产生褐变现象，在成年树尤其严重。培养基中含酚过高会导致褐变，含过高浓度的无机盐和肌醇也会加剧外植体的褐变。6-苄氨基嘌呤(6-BA)和激动素(KT)也有诱导褐变的作用。强光和高温同样会促进褐变现象。

  防治褐变的方法

  1、在培养基中加入抗氧化剂是防止褐变的有效措施。

  常用的抗氧化剂有抗坏血酸(VC)、柠檬酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等，该类药剂一般需用浓度为50-200mg/L。

  具体方法如下：

  (1)用经过滤灭菌的抗氧化剂溶液洗涤刚切割的外植体伤口表面;

  (2)将抗氧化剂加入固体培养基的表层;

  (3)将刚切割的外植体浸入其中一定时间，

  (4)或者在抗氧化剂溶液中切割和剥离外植体。

  (5)必要时还可以将几种抗氧化剂结合使用。

  2、在培养基中加入活性炭，吸附对生长有抑制作用的褐色醌类物质。

  一般认为，活性碳主要吸附非极性物质及色素大分子，可以减少一些有害物质的影响，但是具体吸附的选择性很差，温度低时吸附力增强，温度高时吸附力减弱，甚至会解吸附。通常活性炭的使用浓度为0.5-10g/L。大量活性炭的加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加些琼脂;很细的活性炭容易沉淀，因此通常在琼脂将要凝固时，需轻轻摇动培养瓶;应当注意的是：活性炭也能吸附培养基中的激素类物质，影响茎尖的分化和生长，因此在使用活性炭的场合，需要适当提高培养基中激素的浓度。

  3、不断地(每隔1～2d)将培养物转移到新鲜的培养基上，以摆脱老培养基中褐色物质的不利影响。在使用液体培养基的情况下，这种方法相当有效。

  4、为了防止外植体的褐变，需要选取酚类化合物含量较低的实验材料，选择无机盐含量较低，不加肌醇的培养基，并在较弱的光线或黑暗的条件中进行培养。

  5、易发生褐变的植物在进行组织培养时，先进行预培养(即培养在基础培养基中)2-3天(如果分泌物多，如利用花魔芋的球茎进行组织培养时，适当延长预培养时间并多次更换培养基)，再培养到添加了激素的培养基上。

  组织培养的条件和培养基制备注意事项

  1、植物组织培养的整个操作和培养过程都要求在严格无菌条件下进行，无菌是组织培养成功的首要条件。操作过程在接种室内超净工作台上进行;外植体材料要进行表面消毒;配制的培养基要进行高压灭菌消毒。

  2、温度处理操作和培养过程都是在恒温条件下进行，一般在23—27℃之间，热带植物可偏高些，脱毒植物需要高温处理。

  3、光照处理植物的器官必须有光，某些植物器官的生成是在无光条件下，但它的生长和发育必须有光。茎尖的生长及试管苗的继代增殖以3000-5000lux光照强度适宜;生根试管苗以3000lux适宜。光质对愈伤组织诱导、增殖、器官的分化有不同的影响。光周期诱导一般是16h，黑暗是12h，对光周期敏感植物要掌握光照时间，否则影响植物的分化。

  4、培养基的酸碱度因植物的种类不同而有区别，大多数植物要求在5.8之间，喜酸性培养的植物要求的酸碱度较严格。

  培养基的成分

  1、用于植物组织培养的培养基迄今不下几十种。归纳起来任何一种培养基均有以下几部分组成：无机盐(大量元素、微量元素)，有机化合物(蔗糖、维生素类、氨基酸、核酸及其他水解化合物)，铁盐螯合剂，植物激素。

  植物激素的纯度对于组织培养的成功至关重要。接种的外植体，其分化速度(长芽)和分化方向(长根)，均取决于所加激素的种类、数量及比例。简言之，主要是生长素和细胞分裂素的加入量以及两者的比例。一般生长素类包括吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸;细胞分裂素类包括激动素、苄基氨基嘌呤、二甲基丙烯氨基嘌呤。

  培养基中的糖类主要是蔗糖，少数情况下使用葡萄糖。大量生产可使用蔗糖。糖在培养基中的作用是提供碳源，同时用于维持渗透平衡，琼脂是固体培养基中的成分，作为固化剂支持。培养物在培养基的成本消耗中，琼脂占有相当大的比例，培养基中琼脂的加入量一般为4-7g。

  2、在组织培养生产中，培养基的制备对母液的需求量相当大，需一批一批地连续配制。为简化配制过程，提高工作效率，一般将各种所需药品先配制成高浓度溶液，贮备起来。到配制培养基时，按要求的浓度取一定量稀释即可;我们称这些高浓度的溶液为贮备液，习惯上称母液。

  制备母液时，先将所有药品分成几组，每组药品制成一种母液。分组的原则是同组药品混合溶解时不会发生质的变化，也不产生沉淀。一般将药品分成5组：大量元素、微量元素、铁盐、有机化合物类和植物激素。其中植物激素母液有若干种，每种激素都先制成1mg/ml的溶液。

  母液制备注意事项

  1、药品称量要尽可能准确。大量元素用百分之一天平称取，而微量元素、有机物类、植物激素等，则必须使用万分之一的天平。

  2、母液配制完毕注入试剂瓶后，一定要标明母液的名称、序号、浓度和配制日期等。

  3、配制好的母液应放置在冷藏箱内保存，尤其是有机物和激素类。

  培养基的配制

  1、将用于配制培养基的容器洗净，加入培养基总量四分之三的蒸馏水，放入所需的琼脂和糖，然后加热溶解。在加热过程中应不断地搅拌，以避免琼脂粘锅或溢出。

  2、待琼脂和糖完全溶解后，按顺序加入各贮备液以及所需的植物激素。

  3、用蒸馏水定容补充由于加热蒸发所损失的体积。

  4、用蒸馏水调整pH。

  5、通过漏斗或下口杯将培养基注入组组织培养容器内，注入量为瓶容积的十分之一左右。灌装要迅速，尽可能避免培养基粘在瓶壁上，且应在培养基未冷却之前灌装完毕。

  6、用封口膜或含透气膜的塑料盖将瓶口或试管口封严。

  7、将封装好的组织培养容器码放在高压灭菌锅内。于105Pa压力、121℃下灭菌20分钟。如使用小型手提式灭菌锅时，一定要注意，当锅内压力上升时，先反复放气数次，将锅内空气排尽以后，再计算时间，否则达不到高压灭菌的效果。

  8、对于一些受热易于分解的物质，如维生素类，可采取先过滤灭菌的方法。待培养基灭菌后，尚未冷却之前(40℃左右)加入并摇匀。经过高压灭菌的培养基可在室温下存放3-5天，或在冷藏箱内存放10天左右，最好在短时间内用完。