烟草组培实验的培养基简化探究

烟草(Nicotiana tabacum L.)是常用植物组培材料，组培存活率高，周期较短。中学植物组培实验一直以来存在实验工作繁重、整体实验时间长等问题，培养基的配制繁琐是重要原因之一。目前，科学家对简化培养基配方已进行了相关研究，本实验一方面通过减少烟草组培MS培养基成分探究培养基中的可去除营养成分;另一方面使用马铃薯替代MS培养基中各种成分，通过观察烟草诱导分化现象是否满足中学教学需求，筛选出适合教学的简化培养基配方，达到节约人力成本和提高实验效率的目的。

  1 材料与方法

  1.1 材料 烟草由华南师范大学生科院细胞工程实验室提供;马铃薯(Solanum tuberosum)由市场购得。

  1.2 烟草叶片组培培养基筛选 选取生长良好的嫩绿烟草叶片洗净，在已消毒的工作台下用75%酒精浸泡30s，接着在浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡9min，无菌水冲洗并切块，接入以下培养基中：

  CK. MS培养基+6-BA1.0+NAA0.5(对照组);B. MS培养基-微量元素+6-BA1.0+NAA0.5;C. MS培养基-有机成分+6-BA1.0+NAA0.5;D. MS培养基-微量元素-有机成分+6-BA1.0+NAA0.5;E. MS培养基-微量元素-有机成分+6-BA1.0+NAA0.5+200g/L马铃薯溶液;F. MS培养基-大量元素-有机成分+6-BA1.0+NAA0.5+200g/L马铃薯溶液;G. MS培养基-大量元素-有机成分-微量元素+6-BA1.0+NAA0.5+200g/L马铃薯溶液;H. 200g/L马铃薯溶液。

  每个处理组5瓶，2次重复实验，置于培养架上培养。培养温度为室温;光照强度为25～28μmol/m2·s;光照时间为12 h/d。 接种1～18d观察污染情况;7～45d观察外植体生长情况;25d统计诱导所需时间及芽的分化率;35d统计叶的分化率及根的分化率。

  1.3 数据统计与处理 污染率和芽、叶、根的分化率用SPSS 18.0软件进行方差分析和多重比较(Duncan’s method，0.05)。接种培养的烟草叶片，每3d观察一次，设置6个指标：

  污染率(%)=污染瓶数/总接种瓶数×100;坏死率(%)=褐化外植体数/除去污染的总外植体数×100;愈伤组织诱导率(%)=诱导出愈伤组织的外植体数/除去污染的总外植体数×100; 芽的分化率(%)=分化芽的外植体数/除去污染的总外植体数×100; 叶的分化率(%)=分化叶的外植体数/除去污染的总外植体数×100; 根的分化率(%)=分化根的外植体数/除去污染的总外植体数×100。

  2 结果与分析

  2.1 烟草叶片在缺素MS培养基中的生长状况 如表1所示，比较对照组(MS培养基+6-BA1.0+NAA0.5)和B、C、D四种培养基，将烟草组织培养生长情况从良好到较差进行排序：对照组> B(缺有机成分)> C(缺微量元素)> D(缺有机成分和微量元素)。对比各项指标发现：MS培养基中有机成分对烟草诱导、分化影响不明显，在一定程度上延迟根的分化。MS培养基中的微量元素对烟草诱导、芽的分化影响不明显，对烟草叶、根的分化具有重要作用。同时缺乏微量元素和有机成分的MS培养基已经无法保证烟草组培的正常进行。考虑中学生物学教学节约成本和简化步骤的需求，可以采用缺有机成分的F配方代替MS培养基进行实验教学。

  2.2 烟草叶片在马铃薯替代的缺素MS培养基中的生长状况 如表1所示，对比B-H可以发现相同缺素条件下，添加马铃薯汁的培养基能改善烟草叶片的生长状况。对比对照组(MS培养基+6-BA1.0+NAA0.5)和四种添加马铃薯汁的缺有机成分MS培养基E、F、G、H，将烟草组织培养生长情况从良好到较差进行排序：对照组≥ E(马铃薯汁代替微量元素)> F(马铃薯代替大量元素)= G(马铃薯代替大量元素和微量元素)> H(马铃薯培养基)。马铃薯汁替代微量元素烟草组培生长良好，替代大量元素和微量元素能观察到烟草外植体脱分化、分化出芽、叶和根的现象，但组培苗矮小。考虑到中学教学目标在于学生动手实验，能够明显观察到植物组培诱导、分化情况即可，CK中培养基中G(马铃薯代替大量元素和微量元素)配制时间短，效率高，且基本满足教学需求。原本需要100min才能配制完成的MS培养基，G仅需30min。

  表1 不同培养基对烟草组培生长的影响

  3 讨论

  简化培养基的研究目的在于提高培养基配制效率。国内外学者的研究表明, 马铃薯、菊花等可以使用白糖、自来水代替蔗糖和蒸馏水，对组培效果影响不明显。本实验MS培养基配制使用自来水和蔗糖，结果表明有机成分对烟草组培影响不明显，但未发现其对降低污染率有明显效果。马铃薯培养基在微生物培养中十分常见，但在植物组织培养并未被广泛接受。因为相比促进外植体诱导分化，其对微生物生长更加有利，容易提高污染率而导致实验失败。所以，关于马铃薯作为植物组培简化培养基的研究较少。马铃薯的营养成分涵盖大量元素的所有种类和微量元素的部分种类(除I、B、Mo)。本实验中马铃薯代替微量元素的培养基中外植体愈伤组织、芽、叶均为浅绿色。虽然马铃薯中营养成分种类涵盖范围广，但含量与MS培养基含量有差异，不能达到完全替代的效果。但能保证在教学周期内实验成功完成，观察到外植体正常诱导出愈伤组织，分化出芽、叶和根的现象。

  优化实验条件之后的烟草离体培养实验，满足课程大纲对中学组培实验教学“掌握培养基的配制、外植体消毒、接种、培养等基本操作技术”的实验要求，且未对教学内容产生影响。同时，结合本实验对烟草组培单一配方的筛选结果，可以使用200g/L马铃薯代替MS培养基中的大量元素和微量元素制备烟草组培简化培养基。而该简化培养基使得原本需要配制100min的MS培养基在30min内完成，可大大降低前期准备的工作量，提高组培实验的教学效率，减少组培所需时间和降低人力成本。