树莓品种“波拉纳”组培繁殖体系建立

植物组织培养具有培养周期短，繁殖系数高等优点，是种质资源保存、育种以及遗传转化等研究的有效技术手段，已被广泛应用于农、林业等领域。影响植物组织培养成败的主要因子有树种、品种、外植体、培养基和植物生长调节剂等。

  树莓为蔷薇科悬钩子属树种，其果实营养丰富，具有抗氧化、调节代谢、抗肿瘤、预防心脑血管疾病和增强免疫力等作用，有较大的应用开发价值。树莓优良品种被引入我国已有30多年的历史，栽培面积较大，目前还是以根孽苗繁殖、栽培为主，导致品种退化、产量降低，病虫害问题严重，国外树莓品种栽植上主要采用组培苗，甚至很多国家都采用脱毒苗。“波拉纳”是夏、秋双季结果型红树莓品种，果实较大，口味佳，耐寒，因每芽产生两个结果侧枝而高产，在黑龙江省7月下旬开始采收秋果，适合秋季早霜期较早的地区种植。因此，本研究采用组织培养技术对“波拉纳”进行繁殖研究，以期建立其离体培养再生组培体系，为今后工厂化育苗和种质资源保存等工作奠定基础。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  试验材料为苇河林业局青山种子园采摘园内露地栽培的“波拉纳”2年根蘖苗。

  1.2 试验方法

  1.2.1 外植体消毒及基本培养基的筛选

  取当年新生嫩枝剪成段，放入组培瓶中，滴2～3滴洗洁精，在自来水下冲洗1 h左右。在超净工作台上，用75%的乙醇溶液消毒，消毒时间设定为0、30、50 s，无菌水冲洗1次，转到0.1%的升汞中灭菌，灭菌时间设定为2、4、8 min，再以2%次氯酸钠灭菌，灭菌时间设定为2、4、8 min，无菌水冲洗4次，很后用无菌滤纸吸干表面水份，以WPM、1/2 MS、MS为基本培养基，分别添加0.5 mg/L6BA和0.1 mg/LNAA，将消毒后的带腋芽茎段剪成1～2 cm接种到培养基上，按照正交表L9(34)设计成 9 种不同的处理，每个处理接种40个茎段，重复 3 次。蔗糖 25 g/L，琼脂 6.0 g/L，pH 值 5.8，培养温度25±2 ℃，光周期14 h/d，光照强度2 200 lx，以下试验条件均与此相同。接种一周后统计污染率、褐化率，接种后20 d调查成活率。

  1.2.2 增殖培养

  以MS为基本培养基，添加植物生长调节剂KT、NAA和6 BA，KT浓度设定为0、1.0、2.0 mg/L，NAA浓度设定为0.1、0.2、0.5 mg/L，6 BA浓度设定为0.1、0.5、1.0 mg/L。按照正交表 L9( 34) 设计成 9 种不同的处理。将诱导的芽单独切离下来接种到培养基上，每个处理接种30个芽，分别接种在5个培养瓶中，每瓶接种6个芽，重复 3 次。30 d 后调查其增殖倍数和生长情况。

  1.2.3 生根培养

  以MS为基本培养基，添加IBA，浓度分别设定为0.1、0.5、1.0 mg/L，切取2.0 cm左右健壮一致的微枝转接到生根培养基上诱导生根，共3个处理，每个处理接种50株，重复3次，25 d调查生根率、生根条数。

  1.2.4 数据统计分析

  按下列方法统计污染率、成活率、增殖系数和生根率，采用SPSS21.0软件进行方差分析及多重比较。

  污染率=(外植体污染数/接种外植体数)×100%。

  褐化率=(外植体褐化数/接种外植体数)×100%。

  成活率=(外植体诱导成活数/接种外植体数)×100%。

  增殖系数=增殖的苗数/接种苗数。

  生根率=(生根苗数/接种苗数)×100%。

  2 结果与分析

  2.1 消毒剂、培养基对外植体诱导的影响

  不同消毒方式对外植体灭菌效果有较大影响，选择适宜的消毒剂及浓度直接影响着能否获得大量无菌材料。由表1可见，不同处理间污染率、褐化率和成活率均存在显著、非常显著差异。处理1污染率达到100%，成活率为0;处理3和9虽然无污染，但是大部分材料褐化、甚至死亡，诱导成活率较低，分别为19.63%和39.15%;处理2、4、8污染率较高，处理5和7褐化率较高;而处理6即用75%乙醇处理30 s、0.1%升汞处理8 min、2%次氯酸钠处理2 min效果很好，污染率为2.88%，褐化率为15.93%，成活率为81.11%。

  培养基能提供植物组织生长所必要的养料，选择适宜的培养基是关系组培体系成功的关键因素之一。消毒处理后的茎段接种到1/2 MS、MS、WPM培养基上，未褐化的腋芽培养一周开始萌动，10 d左右叶片开始展开、节间伸长。在MS培养基上，腋芽生长较快，芽生长健壮、嫩绿，在1/2 MS培养基上生长一般，在WPM培养基上生长很慢，因此本研究确定MS为树莓“波拉纳”组织培养的基本培养基。

  表1 消毒剂、培养基类型对树莓“Polana” 腋芽萌发的影响

  注：同一列不同小写字母表示在P= 0.05水平上差异显著，同一列不同大写字母表示在P= 0.01水平上差异非常显著，下同。

  2.2 生长调节剂对芽增殖的影响

  将诱导的幼苗接种到不同植物生长调节剂浓度的MS培养基上，正交试验结果见表2，各处理间增殖系数、苗高均存在非常显著差异。当使用NAA与6-BA植物生长调节剂组合时，切口处逐渐产生褐化的愈伤组织，培养一段时间后植株的叶片逐渐变黄，幼苗生长越来越差，很终死亡。在培养基中添加KT与NAA、6-BA配合使用，10 d后基本逐渐膨大，30 d能够诱导出嫩绿的丛生芽，说明KT对“波拉纳”丛生芽的诱导有重要作用。当使用1.0 mg/LKT与NAA、6-BA组合时，丛生芽的分化能力较强，当使用2.0 mg/LKT与NAA与6-BA组合时，丛生芽分化数量有所减少。9个处理中增殖系数很高的是处理4，与处理7、8、9达到非常显著差异，苗高很高的是处理4，与处理5、9达到非常显著差异。从增殖系数和苗高进行综合评价选出，丛生芽增殖的很佳培养基及植物生长调节剂组合为: MS + KT1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+ 6-BA0.5 mg/L，增殖系数为5.14，苗高为2.89 cm。

  表2 不同生长调节剂及浓度对树莓 “Polana” 丛生芽增殖的影响

  2.3 生根培养

  切取2 cm高，且生长一致健壮的微枝，分别接种到添加不同浓度IBA的MS培养基上进行生根培养，不同处理间生根率、生根条数达到非常显著、显著差异(表3)，当IBA浓度为0.1 mg/L时，生根时间较晚，15 d左右生根，25 d时生根率较低，为86.15%，生根条数为5.25条;当IBA浓度为0.5 mg/L时，一周后开始生根，25 d生根率达到100%，生根条数达到6.14条，主根粗壮。当IBA浓度为1.0 mg/L时，试管苗也是一周左右开始生根，生根率均达到100%，生根率与生根条数与IBA浓度为0.5 mg/L时差异不显著，但是主根细长。

  表3 IBA浓度对树莓“Polana”生根的影响

  3 结论与讨论

  对外植体进行灭菌处理是建立组织培养体系的第一个环节，消毒剂和消毒时间决定着灭菌效果的好坏。消毒处理时间太短则灭菌效果差，外植体会因染菌而逐渐死亡;消毒处理时间太长，消毒剂会导致外植体褐化，甚至直接死亡。针对树莓品种“波拉纳”，本试验筛选出很佳消毒处理方案为：75%乙醇处理30 s+0.1%升汞处理8 min+2%次氯酸钠处理2 min效果很好。

  以往有关树莓组织培养试验中，主要研究了不同品种、不同外植体、培养基及生长调节剂对丛生芽的诱导和生根的影响。植物生长调节剂是组织培养的关键因子之一，且不同植物生长调节剂及浓度对树莓离体材料的诱导及丛生芽分化有显著差异。NAA、6-BA、ZT、KT和 TDZ是诱导树莓外植体分化中常用的植物生长调节物质，而适宜浓度的生长素和细胞分裂素的添加对于不同外植体的分化起决定性作用。研究表明，在“图拉明”(Tulameen)丛生芽诱导过程中，添加0.1 mg/LTDZ与1.0 mg/L BA配合可获得很佳的繁殖效果，但TDZ与IAA配合对“图拉明”生根并没有促进作用。李海燕等(2011)研究表明，6-BA有利于树莓品种“金克维”(Kivigold)丛生芽的继代增殖，但6-BA的浓度应该低于1.5 mg/L。本研究以MS培养基附加不同浓度的KT、NAA和6-BA进行“波拉纳”丛生芽的诱导试验，结果表明KT在丛生芽诱导过程中起关键作用，在不含KT的培养基上，幼苗不分化，长势差逐渐褐化死亡。当使用1.0 mg/LKT时，丛生芽分化能力明显比使用2.0 mg/LKT与NAA与6-BA组合时强，这说明高浓度KT对丛生芽诱导有抑制作用。丛生芽很佳增殖的培养基及植物生长调节剂组合为:MS + KT1.0 mg/·L+ NAA 0.1 mg/L+6-BA0.5 mg/L。

  在植物组织培养过程中，IBA被广泛用于试管苗的生根研究。在“波拉纳”的生根实验中，IBA浓度对生根影响较大，在0.1～1.0 mg/L范围内，随着IBA浓度升高，生根率也随之升高，但并不是随着IBA浓度越大，生根情况越好，IBA浓度为1.0 mg/L时，根细长，状态不好。因此，很适宜“波拉纳”生根的培养基及植物生长调节剂浓度为MS+IBA0.5 mg/L。